产品货号:
BTN101005
中文名称:
致突变PCR试剂盒
英文名称:
Error-Prone PCR Kit
产品规格:
100次
发货周期:
1~3天
产品价格:
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致突变PCR(error-prone PCR)是利用天然Taq DNA多聚酶不具有3'→5'校对功能的特性,在一定条件下(如不同的dNTP浓度、Mg浓度和MnCl2存在)能够按较高的机率引入随机引入突变而设计。如果有适当的突变选择方法,则可从构建的突变库选出所需突变体,用于人工诱变。
- 即开即用,十分简单方便,尤其在生物制药和酶学研究领域显示出了它的优越性。
- 配方经过精心优化,突变率稳定,突变没有趋向性。致突变PCR的突变率为0.66%(±0.13%),详见使用手册疑难解答。
- 比体内基因突变更快捷简单,但如果在PCR引物中设计位点,则可使产物克隆到表达载体,也可以用于体内蛋白活性的筛选。
- 可用于连续致突变PCR(sequential error-prone PCR),只需把上一次致突变PCR的产物用作下一次致突变PCR的模板即可,使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
- 只适用于扩增1kb以下的产物,对于1kb以上的产物,建议分段扩增。
- 本制品足够100次30μL体系的易错PCR反应。
- 本制品只能用于科研。
组分 | 规格 |
10×致突变PCR Mix(含酶) | 300μL |
致突变PCR专用dNTP | 300μL |
致突变PCR增强剂 | 300μL |
追加dNTP,0.5mM | 300μL |
致突变PCR专用MnCl2 | 300μL |
保存:-20℃,有效期1年。
引物、DNA模板、超纯水。
- 将自备的PCR引物稀释到10μM。引物是决定致突变PCR成败的关键因素,设计引物时要保证其Tm在70℃,长度在25~30nt之间,GC含量在45%~60%之间,3'端GC含量低,并且没有发夹结构。
- 用自备引物和自备的常规PCR试剂扩增制备致突变DNA模板(常规PCR产物),胶回收并准确确定浓度。
- 致突变PCR的模板一定要用胶回收的常规PCR产物,因为胶回收可以把电泳不可见的非特异性扩增片段去除,否则这些片段由于也是用致突变PCR引物扩增所得,在致突变PCR扩增时也会被扩增,产生竞争抑制,降低靶分子的扩增效率。如果致突变PCR制备模板的引物和致突变PCR引物不同(类似巢式PCR)则可以避免此问题,但需要合成两对引物。
- 本试剂盒只适用于扩增1kb以下的产物,对于1kb以上的产物,建议分段扩增。
- 致突变PCR的模板一定要用胶回收的常规PCR产物,因为胶回收可以把电泳不可见的非特异性扩增片段去除,否则这些片段由于也是用致突变PCR引物扩增所得,在致突变PCR扩增时也会被扩增,产生竞争抑制,降低靶分子的扩增效率。如果致突变PCR制备模板的引物和致突变PCR引物不同(类似巢式PCR)则可以避免此问题,但需要合成两对引物。
- 将回收的DNA片段(模板)用水稀释到1ng/uL、10ng/uL和100ng/uL三个浓度。
- 模板使用量是影响突变率的最重要因素,因为模板DNA为非突变DNA,扩增产生的DNA为突变DNA,致突变PCR体系跟常规PCR一样,最后会达到扩增平台,最终得到的扩增DNA的量是固定的,因此起始模板DNA使用量越大,则突变DNA在最终得到的总DNA中的相对比例就越低。但模板太少又不容易扩增成功,所以建议同时测试三个模板用量。如果都成功,则优先选用模板浓度低的PCR产物进行分析。
- 设置30μL体系的致突变PCR反应。在一干净的PCR管中,加入下列成分。由于Mn离子容易跟其他成分发生沉淀反应,因此上机前最后加MnCl2:
成分 管1 管2 管3 10×致突变PCR Mix(含酶) 3μL 3μL 3μL 自备DNA模板 1μL(1ng/μL 1μL(10ng/μL) 1μL(100ng/μL) 自备致突变PCR引物(10μM each) 各1μL 各1μL 各1μL 致突变PCR增强剂 3μL 3μL 3μL 致突变PCR专用dNTP 3μL 3μL 3μL 致突变PCR专用MnCl2 3μL 3μL 3μL 超纯水 至30μL 至30μL 至30μL - 立即按下列参数进行易错PCR:
步骤 温度 时间 循环数 PCR前变性 94℃ 3分钟 1 致突变PCR 94℃ 1分钟 30~60 60℃ 1分钟 72℃ 3~10分钟 - 由于致突变PCR含高浓度的镁离子,因此引物容易互为模板形成引物二聚体,因此使用60℃为复性温度。在错误碱基掺入后,DNA合成会暂时停滞,因此为了让DNA合成继续,需要延长合成的时间到3~10分钟。致突变PCR循环次数越多,突变DNA(扩增产物)与非突变DNA(原始模板)的比例就越高。
- 此外在突变率和模板长度恒定的情况下,扩增次数越多,发生突变的绝对数就越高,在同一模板上发生的突变位点数就越多,所以如果需要,可以做30、35、40、45、50、55、60次7个循环数的比较。
- 由于致突变PCR含高浓度的镁离子,因此引物容易互为模板形成引物二聚体,因此使用60℃为复性温度。在错误碱基掺入后,DNA合成会暂时停滞,因此为了让DNA合成继续,需要延长合成的时间到3~10分钟。致突变PCR循环次数越多,突变DNA(扩增产物)与非突变DNA(原始模板)的比例就越高。
- 致突变PCR结束后,各取3μL进行电泳检查。
- 如果有预期大小的PCR产物,则全部电泳,进行胶回收,再进行克隆和测序等后续操作。如果需要增加突变率,可以选择一个突变后的DNA为模板,再进行下一轮致突变PCR。
- 如果没有PCR产物,则按下列操作进行追加PCR。
- 在致突变PCR管中,加入3μL追加dNTP到27μL剩下的致突变PCR体系中,按下表进行追加PCR(chasing PCR)。
步骤 温度 时间 循环数 追加PCR 94℃ 1分钟 20 60℃ 1分钟 72℃ 1分钟 - 追加PCR结束后,再电泳检测。
- 如果有条带,再进行克隆和测序等后续操作。
- 如果需要增加突变率,可以选择一个突变后的DNA为模板,再进行下一轮致突变PCR。
- 如果有条带,再进行克隆和测序等后续操作。
- 如果没有预期大小的PCR产物,则需要分析原因。
- 致突变PCR的错误率是多少?
致突变PCR的突变率为0.66%(±0.13%),对500bp的PCR产物,相当于有4%的PCR片段为野生型,12%的含一个突变,20%的含两个突变,22%的含三个突变,18%的含四个突变,12%的含五个突变,12%的含六个或更多突变。 - 如果需要每个核苷酸有高于0.66%的突变率,如何办?
可以使用连续多次致突变PCR来提高突变率。但最好先用胶纯化回收PCR片段,再用于下一轮PCR。
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